昆虫学报

作者：冯佩林,朱乐冉,臧贺,刘小玉,康婧,邱剑丰,刘锋,徐细建,骆群,陈大福,郭睿,徐国钧

单位：1. 福建农林大学蜂学与生物医药学院, 福州 350002; 2. 天然生物毒素国家地方联合工程实验室, 福州 350002;3. 福建农林大学蜂疗研究所, 福州 350002; 4. 江西省养蜂研究所, 南昌 330000

关键词：西方蜜蜂,东方蜜蜂微孢子虫,肽聚糖识别蛋白,纳米孔测序,剪接异构体

【目的】本研究旨在系统鉴定和分析西方蜜蜂Apis mellifera肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition protein, PGRP)相关基因及其剪接异构体，探析PGRP基因剪接异构体编码蛋白的理化性质和分子特征，并测定PGRP基因剪接异构体在西方蜜蜂工蜂成虫应答东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染中的表达模式，以期为西方蜜蜂PGRP基因剪接异构体的功能研究提供参考和依据。【方法】基于已获得的西方蜜蜂8和11日龄工蜂成虫中肠纳米孔测序数据，利用Blast工具将前期鉴定到的所有全长转录本分别比对到Nr和KEGG数据库，筛选出西方蜜蜂PGRP基因及其剪接异构体，并随机选择PGRP基因的5条剪接异构体通过RT-PCR验证序列的真实性。使用Gffcompare软件将鉴定到的PGRP基因序列比对至西方蜜蜂参考基因组以优化基因结构。采用Astalavista软件鉴定PGRP基因的可变剪接(alternative splicing, AS)事件类型，再通过RT-PCR和Sanger测序验证AS事件。利用相关软件预测和分析PGRP基因剪接异构体编码蛋白的理化性质和分子特征。采用RT-qPCR检测东方蜜蜂微孢子虫接种后西方蜜蜂工蜂成虫中肠中PGRP基因剪接异构体的相对表达量。【结果】共鉴定到西方蜜蜂的4个PGRP相关基因(PGRP-3, PGRP-S2, PGRP-LC和PGRP-LB)及其19条剪接异构体。通过RT-PCR与Sanger测序证实了PGRP基因5条剪接异构体(rna14029, ONT.6350.8, ONT.6350.10, rna24089和ONT.6350.7)的表达和序列真实性。PGRP-3(gene10434)的5′和3′端分别延长了8和1 055 bp， PGRP-S2(gene10435)的5′和3′端分别延长了27和234 bp。通过RT-PCR证实了PGRP-S2的AS事件的真实性。剪接异构体ONT.6350.2编码蛋白的分子式为C966H1502N272O275S7， 分子量约为21 527.63 D， 理论等电点为8.94， 平均亲水性为－0.119，含有信号肽和PGRP结构域，不含跨膜结构域；剪接异构体ONT.6350.6编码蛋白分子式为C841H1301N243O244S5，分子量约为18 860.46 D，理论等电点9.14，平均亲水性为－0.324，不含跨膜结构域和信号肽。西方蜜蜂与东方蜜蜂A. cerana的PGRP-S2在进化树上聚为一支。相较于未接种东方蜜蜂微孢子虫的对照组，接种东方蜜蜂微孢子虫的西方蜜蜂工蜂成虫中肠中剪接异构体ONT.6350.2的表达量在接种后2和4 d时显著上调，在接种后3 d时极显著上调；剪接异构体ONT.6350.6与ONT.6350.2的表达模式相同；剪接异构体ONT.6350.2和ONT.6350.6在接种东方蜜蜂微孢子虫后1－4 d时总体上均表现为上升表达趋势。【结论】本研究优化了西方蜜蜂参考基因组上已注释的PGRP-3和PGRP-S2基因结构；揭示剪接异构体ONT.6350.2的编码蛋白可能是分泌蛋白，而剪接异构体ONT.6350.6的编码蛋白可能是胞内蛋白；西方蜜蜂与东方蜜蜂的PGRP-S2同源性最高；剪接异构体ONT.6350.2和ONT.6350.6在西方蜜蜂工蜂成虫应答东方蜜蜂微孢子虫侵染中被激活表达。

来源：2025年第2期

《昆虫学报》期刊编辑部

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