昆虫学报

作者：叶亚萍,刘治滩,李琪明,臧贺,冯佩林,王宁,王杰,黄枳腱,陈大福,郭睿

单位：1. 福建农林大学蜂学与生物医药学院,福州350002 ; 2 .天然生物毒素国家地方联合工程实验室, 福州350002;3. 福建省蜂疗研究所,福州350002; 4.四川省农业农村厅畜牧总站,成都610041

关键词：西方蜜蜂,AmAGO1,克隆,分子特性,时空表达谱,原核表达,多克隆抗体

【目的】Argonaute (AGO)家族是一类在进化上高度保守的蛋白家族，其在真核生物中主要参与形成RNA诱导沉默复合体(RNA-inducedsilencing complex, RISC)，进而通过沉默基因表达参与诸多生物学过程。蜜蜂AGO蛋白的相关研究迄今仍然缺失。本研究拟通过预测西方蜜蜂Apis mellifera 的AGO1（AmAGO1）理化性质和分子特性，解析AmAGO1在西方蜜蜂中的时空表达谱，并制备AmAGO1的多克隆抗体，为深入开展AmAGO1的功能与机制研究提供参考和基础。【方法】PCR扩增西方蜜蜂AmAGO1的编码序列(codingsequence, CDS)；通过生物信息学预测AmAGO1蛋白的理化性质和分子特性；利用RT-qPCR检测AmAGO1在西方蜜蜂工蜂卵、3日龄幼虫、7日龄预蛹、8日龄预蛹、12日龄蛹以及1, 2, 6, 12, 15和18日龄成虫以及工蜂成虫触角、咽下腺、脑、表皮、中肠、脂肪体和毒腺中的表达量；构建原核表达质粒后诱导表达AmAGO1融合蛋白，并鉴定其表达形式；制备AmAGO1多克隆抗体，利用ELISA, Western blot和免疫沉淀(immunoprecipitation, IP)分别检测抗体效价、灵敏度和特异性。【结果】成功克隆到西方蜜蜂AmAGO1的CDS；AmAGO1含928个氨基酸，分子式为C4624H733 2N1316O1325S51，分子量约为104.2 kD，等电点为9.31，平均亲水系数为–0.2965，含86个磷酸化位点及典型的PAZ结构域和PIWI结构域，但不存在典型的信号肽；AGO1在智人Homo sapiens、斑马鱼Danio rerio、黑腹果蝇Drosophila melanogaster、家蚕Bombyx mori、西方蜜蜂、东方蜜蜂A. cerana和欧洲熊蜂Bombus terrestris中具有较高的氨基酸序列一致性；西方蜜蜂和东方蜜蜂的AGO1聚为一支，同源性最高。AmAGO1在西方蜜蜂工蜂卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫中均有表达但表达量存在差异，3日龄幼虫和7日龄预蛹中AmAGO1的表达量显著低于卵中的表达量，而8日龄预蛹和12日龄蛹中AmAGO1的表达量显著高于卵中的表达量；AmAGO1在1, 2, 6, 12, 15和18日龄工蜂体内均有表达但表达量也存在差异，其中1日龄成虫体内AmAGO1的表达量显著高于其他日龄成虫体内的表达量；AmAGO1在工蜂成虫触角、毒腺、脑、中肠、咽下腺、脂肪体和表皮中均有表达但表达量存在差异，触角中AmAGO1的表达量与咽下腺中的相差无几，但二者均显著高于毒腺、脑、中肠、脂肪体和表皮中AmAGO1的表达量； AmAGO1融合蛋白的表达形式为包涵体；制备的AmAGO1多克隆抗体具有较高的效价、灵敏度和特异性。【结论】AmAGO1可能是亲水性胞内蛋白，含有典型的PAZ结构域和PIWI结构域；AmAGO1在西方蜜蜂工蜂不同组织和不同发育阶段发挥潜在的重要功能；成功制备出高效价、高灵敏度和强特异性的AGO1多克隆抗体。

来源：2024年第1期

《昆虫学报》期刊编辑部

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