昆虫学报

作者：杨小林,凌瑕,孙全,陈洁,向凯,邱品品,洪俊峰,闫振天,王蓉,陈斌,乔梁

单位：1. 重庆师范大学昆虫与分子生物学研究所, 媒介昆虫重庆市重点实验室, 重庆 401331;2. 迅检重庆生命科技有限责任公司, 重庆 400700; 3. 西南大学, 家蚕基因组生物学国家重点实验室, 重庆 400715

关键词：中华按蚊,P2C卵巢导向肽,Gal4蛋白,12×UAS重复基序,非胚胎期外源DNA投递技术系统

【目的】利用P2C可以定向进入卵巢以及Gal4蛋白可与UAS序列稳定结合的特点，在中华按蚊Anopheles sinensis中建立高效的非胚胎期外源DNA投递技术系统。【方法】注射P2C-Gal4-DsRed重组蛋白至吸血后20 h时的中华按蚊雌成蚊腹部，通过冰冻切片荧光观察和Western blot检测分析重组蛋白P2CGal4-DsRed在卵巢中的投递效率；制备P2C-Gal4 DNA BINDING重组蛋白，构建包含12×UAS重复基序的转基因质粒和辅助质粒，通过电泳迁移实验分析重组蛋白P2C-Gal4 DNA BINDING和12×UAS重复基序间的体外结合；分别将体外孵育的P2C-Gal4 DNA BINDING+辅助质粒ITF36-12×UAS和P2C-Gal4 DNA BINDING+转基因质粒ITF2-12×UAS afm复合物注射入吸血后20 h时的中华按蚊雌成蚊腹部，于血餐后40 h时提取其卵巢组织DNA，并通过特异性引物PCR扩增和测序分析外源DNA在活体中的投递情况。【结果】100%注射P2C-Gal4-DsRed的中华按蚊雌成蚊卵巢在绿色滤光片下呈现明显的红色荧光，表明P2C-Gal4-DsRed重组蛋白能够被高效地导入雌成蚊卵巢中；P2C-Gal4 DNA BINDING重组蛋白能够与12×UAS重复基序以及含有该重复基序片段的质粒稳定结合；分别有91%和93%的注射了P2C-Gal4 DNA BINDING+ITF36-12×UAS和P2C-Gal4 DNA BINDING+ITF2-12×UAS afm的雌成蚊卵巢组织中能够检测到外源DNA片段。【结论】在中华按蚊中成功建立了基于P2C卵巢导向肽和Gal4-12×UAS重复基序结合特性的外源DNA投递技术体系；通过此技术平台能够便捷、快速和高效地实现质粒等DNA分子在中华按蚊卵巢中的投递，这为进一步简化转基因、过表达及基因敲入等遗传操作奠定了基础。

来源：2023年第6期

《昆虫学报》期刊编辑部

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