昆虫学报

作者：孙浩,黄镜梅,刘艳,葛文超,王帅,杨凤霞,高聪芬,吴顺凡

单位：1. 南京农业大学植物保护学院, 南京210095; 2. 绿色农药创制与应用技术国家地方联合工程研究中心, 南京210095

关键词：二化螟,基因编辑,CRISPR/Cas9,ebony,标记基因,表型,脱靶效应

【目的】二化螟Chilo suppressalis是中国和其他亚洲地区为害水稻的重要害虫。由于缺乏遗传学操作工具，对二化螟的功能基因组学研究受到严重限制。本研究的目的是借助一个标记基因ebony，在二化螟体内建立CRISPR/Cas9介导的基因编辑体系。【方法】以家蚕Bombyx mori ebony蛋白作为参考序列，通过TBLASTN程序在二化螟基因组数据库获得二化螟ebony基因的cDNA序列；通过PCR技术克隆二化螟ebony全长序列并进行生物信息学分析；运用qRT-PCR技术分析二化螟ebony基因在不同发育阶段(卵、幼虫、预蛹、蛹和雌雄成虫)和4龄幼虫不同组织(头、表皮、脂肪体、肠道和马氏管)中的表达模式；借助基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术，把sgRNA/Cas9蛋白复合物显微注射到二化螟新鲜的卵内(产卵后2 h内)，靶向敲除二化螟ebony基因。【结果】克隆得到二化螟Csebony基因(GenBank登录号: MZ846208)的全长cDNA序列，开放阅读框长为2 586 bp，共编码861个氨基酸。Csebony蛋白质的分子质量为9.5 kD，理论等电点为5.10，且在N端没有信号肽。结构域分析显示，Csebony有3个保守的结构域。系统发育树显示，Csebony与玉米螟Ostrinia furnacalis的ebony亲缘关系最近。qPT-PCR结果显示Csebony基因在蛹期和头部高表达。敲除Csebony导致二化螟幼虫、蛹以及成虫黑色素沉积。【结论】本研究结果表明，Csebony参与了二化螟表皮颜色模式的调控；CRISPR/Cas9基因组编辑技术可在二化螟中有效应用。借助标记基因在非模式生物中快速建立CRISRP/Cas9基因编辑体系，可为二化螟的功能基因组学研究提供有价值的遗传学工具。

来源：2021年第12期

《昆虫学报》期刊编辑部

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