昆虫学报

作者：张文豪,龙诗慧,倪伊璐,张佳慧,李胜,李康

单位：1. 华南师范大学生命科学学院, 广东省昆虫发育生物与应用技术重点实验室, 昆虫科学与技术研究所, 广州 510631； 2. 梅州市华师昆虫发育生物学与应用技术重点实验室广梅园研发中心, 广东梅州 514779

关键词：果蝇,Kc细胞,CRISPR/Cas9,组蛋白甲基化修饰,20-羟基蜕皮酮,Br-C,EcRE

【目的】利用CRISPR/Cas9基因敲除系统在黑腹果蝇Drosophila melanogaster细胞中筛选并检测组蛋白甲基化修饰对蜕皮激素20羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone, 20E)信号传导的调控。【方法】通过Flybase网站分析并总结黑腹果蝇组蛋白甲基转移酶及其修饰位点；将5个组蛋白甲基转移酶基因［trr, Mes-4, ash1, Su(var)3-9和egg］的sgRNA插入到敲除载体pAc-sgRNA-Cas9骨架中并转染黑腹果蝇Kc细胞，利用TA克隆和测序鉴定突变位点。以Trr正调控20E初级应答基因Br-C的转录表达为阳性对照，利用qRT-PCR和Western blot检测该系统敲除靶基因的有效性；通过检测20E应答元件(20E response element, EcRE)双荧光素酶活性确定trr, Mes-4, ash1, Su(var)3-9和egg是否参与20E信号传导。【结果】果蝇组蛋白甲基化修饰主要发生在组蛋白H3的赖氨酸残基上，H3的精氨酸残基和组蛋白H4的甲基化修饰较少。trr敲除载体pAc-trr-sgRNA-Cas9转染Kc细胞后成功突变trr，降低H3K4三甲基化水平并阻断20E对其初级应答基因Br-C的转录诱导，证明该敲除系统的有效性。除trr之外，Mes-4和egg的敲除降低EcRE的双荧光素酶活性。【结论】插入靶标基因sgRNA序列的pAc-sgRNA-Cas9敲除载体在果蝇Kc细胞中可以有效快捷地突变靶基因。利用该敲除系统发现，除Trr之外，Mes-4和egg影响EcRE的活性而参与20E信号传导。本研究为昆虫细胞CRISPR/Cas9介导的基因敲除和组蛋白甲基化修饰调控20E信号传导的深入研究提供了理论依据与工作基础。

来源：2021年第5期

《昆虫学报》期刊编辑部

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