昆虫学报

作者：车林茸,何正波,韩宝珠,陈晓洁,闫振天,乔梁,陈斌

单位：重庆师范大学生命科学学院, 媒介昆虫重庆市重点实验室, 重庆 401331

关键词：中华按蚊,电转化显微注射,增强型绿色荧光蛋白基因,芳香烷基胺-N-乙酰基转移酶基因,瞬时过表达,基因功能

【目的】构建在中华按蚊Anopheles sinensis中的电转化显微注射技术平台，并利用该技术平台实现活体基因瞬时过表达对其进行验证，为开展系统的基因功能研究奠定基础。【方法】以CUY21EDIT Ⅱ电转仪为主体构建中华按蚊中的电转化显微注射技术平台；使用同源重组法构建EGFP和Bm-iAANAT基因的瞬时过表达质粒，在中华按蚊化蛹3 h时注射该质粒进入蛹体，随即使用电转仪对注射后的蛹进行电击，待注射个体发育至化蛹39 h时，利用体视荧光显微镜观察蛹体表皮着色和发光情况，并通过荧光定量PCR检测EGFP和Bm-iAANAT的表达。【结果】构建了用于显微注射的PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV40和 PIZ-modi-Aepub-AANAT-T2A-EGFP-SV40过表达载体。PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV40注射组中华按蚊在化蛹39 h时约87.5%的个体成活并正常黑化，这其中约92.7%的个体的表皮检测到明显的绿色荧光，注射无启动子载体PIZ-modi-EGFP-SV40并进行电击的阴性对照组和注射过表达载体PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV40但未进行电击的阳性对照组个体则没有明显的绿色荧光；并且荧光定量PCR结果显示，注射组中发光个体的EGFP基因明显高表达。PIZ-modi-Aepub-AANAT-T2A-EGFP-SV40注射组的蛹在化蛹39 h时有80.4%个体存活，这其中92.2%的个体相对于注射无启动子载体PIZ-modi-AANAT-T2A-EGFP-SV40的阴性对照组和注射过表达载体PIZ-modi-Aepub-AANAT-T2A-EGFP-SV40但未进行电击的阳性对照组个体黑化明显受阻，且有明显的绿色荧光；并且荧光定量PCR结果显示，报告基因Bm-iAANAT和EGFP的表达明显提高。【结论】成功构建了在中华按蚊中的电转化显微注射技术平台;通过此技术平台能够便捷、快速和高效地实现报告基因在活蛹中的瞬时过表达，并产生了目的表型。这为中华按蚊功能基因组研究奠定了基础。

来源：2019年第5期

《昆虫学报》期刊编辑部

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